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LudwigLab Biocatalysis & Biosensing Research Group

Diaziridine-FAD: A stable cofactor for biocatalysts and a molecular probe

Duration:   2018 - 2021

Project summary

Flavins are key components of many oxidoreductases by serving as prosthetic groups and lending their intricate redox capability to the holoenzyme. Dissociation of FAD leads to an immediate loss of activity and destabilizes the apoenzyme, which compromises the applicability of flavoenzymes in biosensing and biocatalytic applications. Covalent binding prevents dissociation of FAD, but the currently applied genetic or synthetic strategies affect the orientation, catalytic- and redox properties of FAD. Diaziridine functionalization of FAD at the ribityl or adenine group provides universal coupling to the protein scaffold based on specificity and size, without interfering with the redox chemistry of the isoalloxazine group. Photochemical formation of radical species leads to covalent bond formation of the cofactor with amino acids in proximity in correct orientation. Photoaffinity tagging is an established method in medicinal chemistry for covalent receptor-ligand-binding, but its application for linking redox-biocatalysts and cofactors is genuinely novel. This project aims to: (i) synthesize diaziridine functionalized FADs for covalent coupling, (ii) produce native and engineered enzymes used in glucose biosensors for covalent cofactor binding, (iii) study the cofactor occupation of binding-sites, determine stability, enzyme kinetics, redox properties and the performance of the engineered enzymes in biosensors and biocatalysis, and (iv) apply aziridine-FAD as a molecular probe.

Projektzusammenfassung

Flavoenzyme und Flavoproteine sind katalytisch aktive oder funktionell betdeutsame Proteine. Sie kommen in allen Lebewesen vor und enthalten einen Flavinkofaktor (FAD oder FMN). Flavoenzyme sind am Aufbau von Aminosäuren, dem Abbau von Fettsäuren und am Elektronentransport in der Mitochondirenmembran beteiligt. Wirtschaftlich interessant ist ihre Anwendung in der Biotechnologie in der Biokatalyse zur Herstellung von medizinischen Wirkstoffen oder als Bestandteil von Biosensoren. Ein großer Nachteil von Flavoenzymen ist ihre vollständige Inaktivierung und schnelle Denaturierung wenn der Flavinkofaktor aus dem Proteinmolekül dissoziiert, d.h. verlorengeht. Der Verlust des katalytisch wichtigen und die Proteinstruktur stabilisierenden FAD-Kofaktors kann durch eine kovalente Bindung an das Protein verhindert werden. Die Kopplung von FAD durch eine Diaziridingruppe wird durch Licht induziert. Das Projekt untersucht die Herstellung verschiedener Diaziridin-FAD Moleküle und deren kovalente Bindung an verschiedene, für Biosensoren und Bioprozesse, wichtige Enzyme. Die eingesetzen Methoden aus der Chemischen Biologie beeinhalten chemische Synthese, lichtinduzierte Katalyse, Proteinengineering, biochemische Charakterisierung und Anwendungsstudien. Das Ziel der Studie ist es stabile Enzyme herzustellen, die für bessere Biosensoren zur Blutzuckermessung, eine kostengünstigere Herstellung von Medikamenten und zur Analyse von Krankheiten eingesetzt werden können.